第106回薬剤師国家試験
◆ 問113
検体中における、ある微生物の存在を調べるために、リアルタイム PCR法を実施した。以下に示す測定手順で行い、測定した結果を図に示す。この実験に関する記述のうち、正しいのはどれか。2つ選べ。測定手順
3つの検体（試料1～3）をサンプルチューブに別々に採取し、それぞれにDNA抽出用の試薬を加える。→抽出したDNAを定量する。→各検体から一定量のDNAを別々のチューブに取り、それぞれのチューブに二本鎖DNAを検出する蛍光色素、デオキシヌクレオチド混合物、プライマー1組、 酵素を含む反応液を加えて、PCR を開始する。→蛍光強度を測定することで、反応産物が増幅されていく経過を追いながら、PCRを約40サイクルまで繰り返す。
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目的とする微生物の存在量が最も多かったのは、試料3である。
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この測定手順で、細菌、DNAウイルス及びRNAウイルスの検出が可能である。
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試料1と試料3に含まれる微生物の存在量は、約106 倍異なると推定される。
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各試料とも25サイクルを超えるあたりから曲線が頭打ちになる主な原因は、 デオキシヌクレオチドが枯渇するためである。
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PCR開始時に反応液に加える酵素には耐熱性のものを用いる。
◆ 問113
◆領域・タグ
◆正解・解説
正解：4、5
１ 誤
はじめに採取した検体に含まれる微生物が多いほど、一定数のDNAができるまでのPCRの回数は少ない。設問の図より、蛍光強度が閾値を越えるまでのサイクルの数が試料1＜2＜3であることから、目的とする微生物の存在量が最も多かったのは、試料1であると推察できる。
２ 誤
この試験ではDNA抽出用の試薬を加えていることから、細菌、DNAウイルスの検出は可能であるが、RNAウイルスの検出はできない。なお、RNAウイルスを検出するためには、RNAを用いて、逆転写反応により相補的DNA（cDNA）を合成し、PCR法を融合した逆転写PCR法を行う必要がある。
３ 誤
RCRでは、1サイクルごとにDNAが2倍量となる。試料1、試料3、それぞれの蛍光強度が閾値を越えるまでのサイクルが20回、26回であることから、試料1と試料3に含まれる微生物の存在量は約 26 倍異なると推定される。
４ 正
PCRにおいて、DNA合成するためにはデオキシヌクレオチドを必要とする。そのため、PCRのサイクル数が増加するに伴ってデオキシヌクレオチドが消費されるとともにDNA増幅率が減少する。
５ 正
PCRでは、高温条件下での変性を防止する目的で耐熱性DNAポリメラーゼを添加する。
